Espectrofotometría. Análisis en 3 pasos

Espectrofotometria

La espectrofotometría es una técnica experimental que se utiliza para medir la concentración de solutos en una solución específica calculando la cantidad de luz absorbida por esos solutos.

Esta técnica es poderosa porque ciertos compuestos absorberán diferentes longitudes de onda de luz a diferentes intensidades. Mediante el análisis de la luz que pasa a través de la solución, puede identificar sustancias disueltas particulares en solución y cuán concentradas están esas sustancias. Un espectrofotómetro es el dispositivo utilizado para analizar soluciones en un entorno de investigación de laboratorio.

Tabla de Contenidos()

    Paso 1: Preparación de las muestras

    1. 1 Encienda el espectrofotómetro. La mayoría de los espectrofotómetros necesitan calentarse antes de que puedan dar una lectura precisa. Encienda la máquina y déjela reposar durante al menos 15 minutos antes de ejecutar cualquier muestra.
      • Utilice el tiempo de calentamiento para preparar sus muestras.
    2. 2 Limpie las cubetas o tubos de ensayo. Si usted está haciendo un laboratorio para la escuela, es posible que esté usando tubos de análisis desechables que no necesitan ser limpiados. Si está utilizando cubetas o tubos de ensayo reutilizables, asegúrese de que estén correctamente limpiadas antes de su uso. Enjuague bien cada cubeta con agua desionizada.
      • Tenga cuidado con las cubetas, ya que pueden ser bastante caras, especialmente si están hechas de vidrio o cuarzo. Las cubetas de cuarzo están diseñadas para su uso en espectrofotometría uv-visible.
      • Al manipular la cubeta, evite tocar los lados por los que pasará la luz (generalmente, los lados claros del recipiente).
      • Si accidentalmente toca estos lados, limpie la cubeta hacia abajo con una Toallita (que están formulados para evitar que se rasquen el vidrio).
    3. 3 Cargue el volumen adecuado de la muestra en la cubeta. Algunas cubetas tienen un volumen máximo de 1 mililitro (ml), mientras que los tubos de ensayo pueden tener un volumen máximo de 5 ml. Mientras el láser que produce la luz pase a través del líquido y no una parte vacía del recipiente, obtendrá una lectura precisa.
      • Si está utilizando una pipeta para cargar las muestras, utilice una nueva punta para cada muestra para evitar la contaminación cruzada.
    4. 4 Prepare una solución de control. Conocida como un espacio en blanco, la solución de control sólo tiene el disolvente químico en el que se disuelve el soluto a analizar. Por ejemplo, si tuvieras sal disuelta en agua, tu espacio en blanco sería sólo agua. Si tiñe el agua de color rojo, el espacio en blanco también debe contener agua roja. El espacio en blanco es el mismo volumen que la solución que se va a analizar y mantener en el mismo tipo de contenedor.
    5. 5 Limpie el exterior de la cubeta. Antes de colocar la cubeta en el espectrofotómetro desea asegurarse de que esté lo más limpia posible para evitar interferencias de suciedad o partículas de polvo. Con un paño libre de pelusas, retire las gotas de agua o el polvo que pueda estar en el exterior de la cubeta.

    Paso 2: Ejecutar el experimento

    1. 1 Elija y establezca la longitud de onda de la luz con la que analizar la muestra. Utilice una sola longitud de onda de luz (color monocromático) para hacer la prueba más eficaz. El color de la luz elegida debe ser uno conocido por ser absorbido por uno de los productos químicos que se cree que están en el soluto de prueba. Establezca la longitud de onda deseada de acuerdo con las especificaciones de su espectrofotómetro.
      • En un laboratorio del salón de clases, es probable que se le dé la longitud de onda.
      • Debido a que la muestra reflejará toda la luz del mismo color que aparece, la longitud de onda experimental siempre será de un color diferente al de la muestra.
      • Los objetos aparecen como ciertos colores porque reflejan la luz de longitudes de onda particulares y absorben todos los demás colores. La hierba es verde porque la clorofila en ella refleja la luz verde y absorbe todo lo demás.
    2. 2 Calibre la máquina con el espacio en blanco. Coloque el espacio en blanco en el soporte de la cubeta y cierre la tapa. En un espectrofotómetro analógico, habrá una pantalla con una aguja que se mueve en función de la intensidad de la detección de luz. Cuando el espacio en blanco está adentro, usted debe ver la aguja se mueve a la derecha. Registre este valor en caso de que lo necesite para más adelante. Con el espacio en blanco en la máquina, mueva la aguja a cero usando la perilla de ajuste.
      • Los espectrofotómetros digitales se pueden calibrar de la misma manera, solo tendrán una lectura digital. Ajuste el espacio en blanco a 0 con las perillas de ajuste.
      • Cuando retire el espacio en blanco, la calibración seguirá estando en su lugar. Al medir el resto de sus muestras, la absorbancia del espacio en blanco se restará automáticamente.
      • Asegúrese de utilizar un único espacio en blanco por sesión para que cada muestra se calibre en el mismo espacio en blanco. Por ejemplo, si deja en blanco el espectrofotómetro, luego analiza solo algunas muestras y vuelve a en blanco, las muestras restantes serían inexactas. Tendrías que empezar de nuevo.
    3. 3 Retire el espacio en blanco y pruebe la calibración. Con el espacio en blanco quitado la aguja debe permanecer en 0 (cero) o la lectura digital debe continuar leyendo 0. Vuelva a colocar el espacio en blanco en la máquina y asegúrese de que la aguja o la lectura no cambien. Si la máquina está correctamente calibrada con su espacio en blanco, todo debe permanecer en 0.
      • Si la aguja o la lectura no es 0, repita los pasos de calibración con el espacio en blanco.
      • Si continúa teniendo problemas, busque ayuda o haga que la máquina sea examinada para el mantenimiento.
    4. 4 Mida la absorbancia de su muestra experimental. Retire el espacio en blanco y coloque la muestra experimental en la máquina. Deslice la cubeta en la ranura designada y asegúrese de que esté en posición vertical. Espere unos 10 segundos hasta que la aguja esté estable o hasta que los números digitales dejen de cambiar. Registre los valores de % de transmitancia y/o absorbancia.
      • La absorbancia también se conoce como densidad óptica (OD).
      • Cuanta más luz se transmita, menos luz absorbe la muestra. Por lo general, desea registrar los valores de absorbancia que normalmente se darán como decimales, por ejemplo, 0,43.
      • Si obtiene un resultado de salida (como 0.900 cuando el resto es alrededor de 0.400), diluya la muestra y mida la absorbancia de nuevo.
      • Repita la lectura para cada muestra individual al menos 3 veces y promediarlas juntas. Esto garantiza una lectura más precisa.
    5. 5 Repita la prueba con longitudes de onda sucesivas de luz. Su muestra puede tener múltiples compuestos desconocidos que variarán en su absorbancia dependiendo de la longitud de onda. Para eliminar la incertidumbre, repita sus lecturas a intervalos de 25 nm en todo el espectro. Esto le permitirá detectar otros productos químicos sospechosos de estar en el soluto.

    Paso 3: Análisis de los datos de absorbancia

    1. 1 Calcular la transmitancia y absorbancia de la muestra. La transmitancia es la cantidad de luz que pasó a través de la muestra alcanzó el espectrofotómetro. La absorción es la cantidad de luz que ha sido absorbida por uno de los productos químicos en el soluto. Muchos espectrofotómetros modernos tienen una salida de transmitancia y absorbancia, pero si registraste la intensidad, puedes calcular estos valores.
      • La transmitancia (T) se encuentra dividiendo la intensidad de la luz que pasó a través de la solución de la muestra con la cantidad que pasó a través del espacio en blanco. Normalmente se expresa como un decimal o porcentaje. T - I/I0 donde es la intensidad de la muestra y I0 es la intensidad del espacio en blanco.
      • La absorbancia (A) se expresa como el negativo del logaritmo base-10 (exponente) del valor de la transmitancia: A - -log10T.
      • Para un valor T de 0,1, el valor de A es 1 (0,1 es 10 a la potencia -1), lo que significa que se transmite el 10% de la luz y se absorbe el 90%. Para un valor T de 0.01, el valor de A es 2 (0.01 es 10 a la potencia -2), lo que significa que se transmite el 1% de la luz.
    2. 2 Trazar los valores de absorbancia frente a las longitudes de onda en un gráfico. El valor de absorbancia se traza en el eje Y vertical contra la longitud de onda de la luz utilizada para una prueba determinada trazada en el eje X horizontal. La gráfica de los valores máximos de absorbancia para cada longitud de onda de luz probada, produce el espectro de absorbancia de la muestra e identifica los compuestos que componen la sustancia de ensayo y sus proporciones.
      • Un espectro de absorbancia generalmente tiene picos en ciertas longitudes de onda que pueden permitirle identificar compuestos específicos.
    3. 3 Compare su gráfica de espectro de absorbancia con parcelas conocidas de compuestos específicos. Los compuestos tienen un espectro de absorbancia único y siempre producirán un pico en la misma longitud de onda cada vez que se miden. Al comparar sus parcelas de compuestos desconocidos con las de compuestos conocidos, puede identificar los solutos que componen su solución.
      • También puede utilizar este método para identificar contaminantes en la muestra. Si usted está esperando 1 pico claro en una longitud de onda específica y obtiene 2 picos en longitudes de onda separadas, usted sabe que algo no está bien en su muestra.

    Espectrofotometría. Cómo hacer un análisis en 3 pasos
    Co-autor por:Meredith Juncker, PhD Investigador Científico. En este artículo fue co-autor por Meredith Juncker, PhD. Meredith Juncker es candidata al doctorado en Bioquímica y Biología Molecular en el Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad Estatal de Luisiana. Sus estudios se centran en proteínas y enfermedades neurodegenerativas.